Секвенирование ДНК - что, как и почему.

Наверняка каждый что-то слышал о программе «Геном Человека» – международном проекте по определению полной последовательности человеческого генома. Целью проекта, помимо определения последовательности более чем 3 миллиардов нуклеотидов, содержащихся в гаплоидном человеческом геноме (то есть одинарном наборе хромосом одной клетки), была идентификация всех генов человека. Проект стартовал в 1990 году и официально финишировал в 2003 году, проводился в десятках научных центров по всему миру, а на его осуществление было потрачено около трёх миллиардов долларов.

Джеймс Уотсон – Нобелевский лауреат и первооткрыватель структуры ДНК – был одним их первых, чей индивидуальный геном был расшифрован. Это произошло в 2007 году и стоило уже меньше, около 1,5 миллиона долларов.

«Однажды я сидел за рулём Bentley — это хорошая машина», – говорит Джеймс Уотсон. «Что бы я предпочёл – узнать полную последовательность моего генома или иметь Bentley? Пожалуй, я бы выбрал геном, потому что он может рассказать о генах, определяющих предрасположенность к заболеваниям. С генами я передам моим детям и предрасположенность к ряду заболеваний, хотя, может быть, и не заболею ими сам».

За последние годы технологии секвенирования ДНК изменились до неузнаваемости, и сегодня современные секвенаторы (от англ. sequence – последовательность) в состоянии расшифровать индивидуальный человеческий геном за несколько часов, а стоимость такого анализа составляет лишь 1000$. Устройство, которое способно изменить Вашу жизнь, имеет размеры стиральной машины и очень сильно отличается от громоздких и сложных в использовании секвенаторов двадцатилетней давности. Это стало возможным благодаря нескольким открытиям и прорывным методам, концептуально простым, но достаточно сложным с технологической точки зрения. Но обо всём по порядку.

Геном человека – энциклопедия, написанная четырьмя буквами. В последовательности четырёх нуклеотидов ДНК – производных азотистых оснований аденина, гуанина, цитозина и тимина – закодирована информация о структуре всех белков нашего организма. Каждая из двадцати протеиногенных аминокислот, которые являются структурными единицами белка, зашифрована последовательностью из трёх нуклеотидов. Все виды растений и животных, и даже каждый из нас с Вами имеет особый, только ему присущий набор белков, который делает нас такими, какие мы есть. А значит, установив структуру генов конкретного человека (а геном обычно называют участок ДНК, несущий информацию об одном белке), можно сказать очень многое о его генетических предрасположенностях к определенным заболеваниям.

Действительно, генетический скрининг родителей определяет, являются ли они носителями нежелательных вариантов генов для их будущих детей (например, тест на совместимость по HLA-антигенам или предрасположенность к серповидноклеточной анемии). Пренатальная диагностика плода включает проверку на наличие анеуплоидий, самой известной из которых является трисомия по 21-й хромосоме – синдром Дауна. Дети, рождённые с редкими генетическими заболеваниями, смогут получать точечное лечение, что снизит возможность ошибочных диагнозов и лечения наугад. Расшифровка генома взрослого человека расскажет персональную информацию о предрасположенностях к различным заболеваниям, индивидуальным реакциям на лекарства, физиологических характеристиках организма, склонностях к видам спорта, происхождении и многом другом.

Отдельная и крайне важная область – онкология. В течение жизни человека его клетки накапливают ряд изменений в геноме, начиная от точечных мутаций отдельных нуклеотидов и заканчивая более крупными перестройками хромосом. Изучая изменения в генах, контролирующих клеточный цикл и смерть клетки (апоптоз) или участвующих в репарации (восстановлении и защите) ДНК, можно выявить конкретные причины болезни и подобрать персонализированную терапию для каждого отдельного случая.
Наконец, за стенами лабораторий, в странах третьего мира, спасатели будут с помощью переносных устройств искать в питьевой воде микробов — возбудителей эпидемий.

В ходе программы «Геном Человека» было установлено, что количество генов в геноме человека составляет примерно 28 тысяч. Это намного меньше, чем ожидалось найти изначально (более 100 тысяч генов), и ненамного больше, чем у более простых организмов, например, у плодовой мушки. Всё же, человек устроен значительно сложнее плодовой мушки: в частности, у человека широко представлен альтернативный сплайсинг – ситуация, когда из одного гена получается несколько белков.
Одним из первых методов секвенирования ДНК (именно его применяли в ходе проекта «Геном Человека»), широко используемым и сегодня, является метод Сэнгера. Фредерик Сэнгер получил за него Нобелевскую премию по химии. Для того, чтобы понять, как работает метод, необходимо разобраться в сущности Полимеразной Цепной Реакции (ещё одна Нобелевская премия по химии).

ПЦР представляет собой процесс многократного копирования определённого фрагмента ДНК в искусственных условиях, схожий с естественным процессом удвоения ДНК в клетке во время её деления. Для протекания реакции образец ДНК, который требуется копировать, смешивают со свободными нуклеотидами (А, Г, Ц и Т – о них мы уже говорили выше), праймерами и ферментом ДНК-полимеразой, который, собственно, и проводит «синтез» цепи. Праймеры – это короткие цепочки нуклеотидов, комплементарные определённым участкам исходной цепи нуклеотидов. Комплементарность двух нуклеотидов означает, что они вследствие водородных связей способны связываться друг с другом, причём аденин связывается только с тимином, а гуанин – только с цитозином. Праймеры узнают строго специфичные участки образца ДНК, присоединяются к ним, а затем на эти же участки садится фермент и начинает синтезировать копию образца ДНК. За 20 циклов синтеза из одной молекулы ДНК можно получить более миллиона копий.

Суть метода секвенирования по Сэнгеру заключается в получении четырёх наборов меченых фрагментов ДНК в ходе Полимеразной Цепной Реакции, причём все фрагменты одного набора имеют на одном из концов (назовём его 3'-конец) определённый нуклеотид. Заметим, что наборов фрагментов четыре – столько же, сколько типов нуклеотидов. В реакцию помимо обычных нуклеотидов (dNTP) добавляют и химически модифицированные дидезоксинуклеотиды (ddNTP), с которыми ДНК-полимераза не в состоянии работать – как только в цепочку встроился дидезоксинуклеотид, её синтез обрывается, и фермент начинает синтез новой цепи. Каждый дидезоксинуклеотид связан с флуоресцентной молекулой, которая окрашивает все фрагменты ДНК, заканчивающиеся на конкретный нуклеотид, в один и тот же цвет. Таким образом, ДНК-полимераза синтезирует огромное количество фрагментов ДНК разной длины, окрашенных в один из четырёх цветов. Все они затем разделяются по размеру с помощью капиллярного электрофореза – фрагменты одной длины мигрируют по капилляру, заполненному гелем, с одной скоростью и в конечном итоге образуют один пик. Цвет каждого пика определяется лучом лазера, который проходит через детектор. Последовательность «цветов» в данном случае соответствует последовательности нуклеотидов.
222.jpg
Современные методы секвенирования, или методы секвенирования нового поколения, отличаются от более ранних технологий в первую очередь тем, что позволяют параллельно «прочитать» миллионы различных участков генома. На нескольких квадратных миллиметрах ДНК-чипа, главного элемента такой генной машины, умещается гигантское количество ячеек, каждая из которых является отдельным реактором, в котором проводятся однотипные манипуляции с ДНК.

Самая распространённая на сегодняшний день технология секвенирования, которая занимает две трети рынка объёмом $7 млрд в год, разработана компанией Illumina и носит название «секвенирование путём синтеза». Эта замечательная технология по сути является логическим продолжением метода Сэнгера, поскольку выяснение последовательности нуклеотидов здесь происходит в процессе полимеразной цепной реакции.
111.jpg
ДНК, которая подлежит анализу, предварительно разрезается на множество коротких фрагментов одинакового размера. Затем они связываются с праймерами, прикреплёнными к подложке ДНК-чипа. Далее проходит так называемая «мостиковая ПЦР», в результате которой на месте связывания фрагмента ДНК с праймером образуется множество его копий.

Наконец, проводится секвенирование путём синтеза. Присоединение к растущей цепочке ДНК каждого нового нуклеотида, соединённого с флуоресцентной меткой, вызывает локальное «изменение цвета» той ячейки ДНК-чипа, на которой закреплена именно эта растущая цепь. Ячейка фотографируется камерой, а поскольку копий каждого фрагмента очень много, то одновременное излучение определённой длины волны всеми копиями удаётся детектировать. Как и в случае метода Сэнгера, последовательность «цветов» соответствует последовательности нуклеотидов цепи ДНК.

Нам с Вами безумно повезло! Мы живём в эпоху, когда наука и технологии позволяют заглянуть в тайны, которые ещё недавно находились за пределами возможного. Не далёк тот день, когда наличие данных расшифрованного генома на приёме у врача будет таким же обязательным для любого пациента, как, например, анализ крови.

наукажизньбиологияголособразование
25%
26
104
0.091 GOLOS
0
В избранное
johnybravo
На Golos с 2018 M01
104
0

Зарегистрируйтесь, чтобы проголосовать за пост или написать комментарий

Авторы получают вознаграждение, когда пользователи голосуют за их посты. Голосующие читатели также получают вознаграждение за свои голоса.

Зарегистрироваться
Комментарии (8)
Сортировать по:
Сначала старые